這個問題出自XXX領(lǐng)導(dǎo)之口

那小編我著實需要好好捋捋

為此小編我整日抓耳撓腮

百思不得其解

按理來說，RNA的質(zhì)量沒問題（28s和18s rRNA是否清晰、明顯，亮度比符合2:1），那么RT產(chǎn)生的cDNA一般是不會出現(xiàn)問題的。但是偏偏有那么些個博學(xué)多才、才高八斗的抖機(jī)靈們想要一探究竟！

作為2G沖浪選手，小編我也機(jī)靈了一回

聽聽學(xué)霸網(wǎng)友們的聲音

一號學(xué)霸：

一般可以用電泳檢測是否合成適當(dāng)大小片段的帶，這方法看cDNA大小沒問題（自信）；如果想看堿基那當(dāng)然還是測序或者使用探針檢測，就是比較麻煩（一如既往的自信）。

cDNA的質(zhì)量不好判斷，因為cDNA產(chǎn)物是smear，所以只能根據(jù)smear的分布范圍大概估計cDNA的質(zhì)量，分布范圍越大越好。但是，電泳看到的smear因為還和加樣量相關(guān)，所以即使沒有看到分布很廣的cDNA一鏈，也并不等于它不存在（淡定如斯）。

三號學(xué)霸：

用PCR檢測合成的cDNA中管家基因的量，如果出現(xiàn)比較好條帶，基本可以證實你的cDNA沒有問題，我們實驗室一直這樣控制（眾人）。

如果不怕煩的話，可以在反轉(zhuǎn)第一鏈時加入少量同位素標(biāo)記的dNTP，然后看一下放射比活度或做個放射自顯影（別出心裁）。

五號學(xué)霸：

首先看你用什么方法合成cDNA，如果隨機(jī)引物合成，三號的建議可以考慮（因為管家基因片段多數(shù)較短）。如果是LD PCR，則這些內(nèi)參可能無法檢驗結(jié)果的好壞（有條有理）。

ds?cDNA檢測我倒是做過（LD PCR），理論上由總RNA起始的，哺乳動物應(yīng)該1.2%濃度的瓊脂糖凝膠于0.5~6kb（可達(dá)10kb以上）有明顯的smear，且有一些明顯的亮帶（腦、脾、胸腺除外）（過來人代表）。

七號學(xué)霸

做內(nèi)參照啊！如GAPDH,β-actin,β-MG等（言簡意賅）。

.........（好多學(xué)霸，真好！）

這么多學(xué)霸出謀劃策，你，懂了嗎？

為了防止有人和小編一樣可愛，英語、術(shù)語分不開，我先來解釋一下：

Smear：彌散帶

LD PCR：全稱Long Ditance PCR即長片段PCR

ds?cDNA：指依靠DNA聚合酶，與cDNA相互補(bǔ)的第二鏈cDNA

選擇試劑盒：您做RT實驗想得到什么樣的產(chǎn)物呢？

不含RNase H（合成長度更長）

預(yù)混組分（簡單高效快捷）

一步法（輕松得到雙鏈cDNA）

? ? ? ?取約5ul反應(yīng)產(chǎn)物，在1%瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色，紫外成像檢測，呈現(xiàn)出大小在200-10Kb的拖帶，其中重心區(qū)域小1-4Kb之間，這說明反轉(zhuǎn)錄完全，得到了高質(zhì)量的cDNA（如果RNA豐度低，電泳也可能是無產(chǎn)物，但是這種情況不代表PCR會無結(jié)果）。

cDNA測序（受限較多，但結(jié)果精準(zhǔn)）

? ? ? ?全長雙鏈cDNA做分子克隆實驗，然后通過測序結(jié)果精確判斷。

a.? Oligo(dT)18和Random Primers按比列使用可解決poly(A) mRNA模板限制和長度限制的問題

b.? 序列特異性引物可獲得你想要得目的序列

探針檢測（相對較麻煩，但結(jié)果較精準(zhǔn)）

? ? ? ?qPCR或RT-qPCR步驟

管家基因/內(nèi)參基因（引物類型限制，適用范圍受限）

? ? ? ?以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，擴(kuò)增內(nèi)參基因，擴(kuò)增有結(jié)果，說明cDNA的質(zhì)量基本可以保證，這個方法限制于隨機(jī)引物擴(kuò)增（因為管家基因片段多數(shù)較短）。

? ? ? ?而Oligo(dT)18與序列特異性引物擴(kuò)增或我們做LD PCR（2kb、10kb等長片段）時，這些內(nèi)參擴(kuò)增的幾率遠(yuǎn)大于全長或大片段cDNA的擴(kuò)增，這時可能就無法通過內(nèi)參來檢驗cDNA擴(kuò)增結(jié)果的好壞。

同位素標(biāo)記

? ? ? ?反轉(zhuǎn)錄中加入少部分同位素標(biāo)記的dNTP

? ? ? ?放射比活度或放射自顯影檢測